Скромный школьник-ботаник Питер Паркер (Тоби Магуайр) живёт обычной жизнью и тайно питает любовь к своей соседке и однокласснице Мэри Джейн Уотсон (Кирстен Данст). Питера не уважают одноклассники, обзывают и всячески издеваются над ним. У Питера нет друзей, кроме богатого красавца и школьного плейбоя Гарри Озборна (Джеймс Франко). Питер увлекается фотографией, но больше ничем похвастаться не может — он сирота, живёт с небогатыми, но любящими дядей и тетей. Но однажды на экскурсии его кусает паук с измененной ДНК. Через некоторое время Питер обнаруживает у себя способности, которых нет у обычного человека — огромную силу, выносливость, умение лазать по стенам и потолкам и возможность выпускать паутину.
Питер решает использовать свои способности, чтобы выиграть деньги на машину и произвести впечатление на Мэри Джейн. Он выигрывает поединок с реслером Молотом Магро в бою без правил, но его обманывают и оставляют без выигрыша, выплатив лишь 100 долларов от обещанной суммы. Когда организаторов грабят, Питер из мести отказывается помогать. После того, как грабитель (Майкл Пападжон) убивает Бена Паркера (Клифф Робертсон), дядю Питера, тот в порыве горя случайно убивает его и понимает, что его предназначение — это борьба с преступностью. Тем временем Норман Озборн (Уиллем Дефо), отец Гарри Озборна, финансирующий разработки в военной сфере, решает провести эксперимент на себе, доказав тем самым перспективность своих идей. В результате эксперимента он превращается в злобного Зелёного гоблина, способного на всё ради своей цели. Попутно показывают, как Питер устраивается на работу фотографом. Он должен фотографировать Человека-паука, то есть себя.
В финальной битве главный антагонист, Зелёный гоблин, берёт в заложники Мэри Джейн и фуникулер с детьми. Затем он ставит Человека-паука перед выбором: спасти Мэри Джейн или детей. Питер спас и Мэри Джейн, и фуникулер с детьми. Из этой смертельной схватки Человек-паук с трудом выходит победителем. Зелёный гоблин пытается убить Питера, но случайно убивает себя собственным же глайдером. Последними словами Нормана Озборна были мольбы о пощаде, прощении, снисхождении. А также он просит ни о чём не рассказывать Гарри. В тот самый момент, когда Человек-паук переносит бездыханное тело Озборна домой, Гарри его замечает и загорается желанием отомстить.
Фильм заканчивается любовной сценой между Питером Паркером и Мэри Джейн Уотсон, в которой зрителю намекают о том, что Мэри Джейн всё-таки догадывается о двойной жизни Питера Паркера. На похоронах Нормана Озборна его сын — Гарри Озборн — рассказывает своему закадычному другу Питеру о намерениях воздать по заслугам Человеку-пауку.
